摘要：【目的】通過肌原纖維蛋白生化特性的變化，考察生物保鮮劑結(jié)合真空浸漬處理在羅非魚冰溫貯藏中的應(yīng)用效果。【方法】分別將羅非魚片進(jìn)行蒸餾水常壓浸漬(對照組)、生物保鮮劑常壓浸漬、生物保鮮劑真空浸漬處理，后測定冰溫保藏過程中肌原纖維蛋白的鹽溶性、Ca2+-ATPase酶活性、總巰基含量、表面疏水性和羰基含量。【結(jié)果】與對照組對比，生物保鮮劑處理常壓浸漬和真空浸漬組冰溫貯藏5d后的表面疏水性、Ca2+-ATPase酶活性，10d后的肌動球蛋白的鹽溶性、總巰基含量和羰基含量與對照組出現(xiàn)顯著差異(<0.05)，而VI浸漬和常壓浸漬組之間此時的相應(yīng)指標(biāo)對比并無顯著差異(>0.05);真空浸漬組在10d表面疏水性、Ca2+-ATPase酶活性、總巰基含量，15d的肌動球蛋白的鹽溶性、20d羰基含量與常壓浸漬組出現(xiàn)顯著差異(<0.05)。在貯藏期間，對照組的各肌原纖維蛋白(MP)相關(guān)指標(biāo)變化顯著，VI組各指標(biāo)在30d的貯藏時間內(nèi)變化最平緩。真空浸漬結(jié)合生物保鮮劑處理能使冰溫羅非魚的貯藏期延長到30d。【結(jié)論】生物保鮮劑結(jié)合真空浸漬預(yù)處理工藝能進(jìn)一步保護(hù)肌原纖維蛋白構(gòu)象的完整性，延緩蛋白質(zhì)氧化進(jìn)程，改善羅非魚片在冰溫貨架期的品質(zhì)。
關(guān)鍵詞：真空浸漬;生物保鮮劑;冰溫;羅非魚;肌原纖維蛋白
羅非魚(Oreochromisniloticus)蛋白質(zhì)含量高，在貯藏與運輸過程中易受自身內(nèi)源酶和微生物生長繁殖及氧化作用等影響，導(dǎo)致肌原纖維蛋白(MP)的鹽溶性、Ca2+-ATPase酶活性、總巰基含量、羰基含量以及表面疏水性等生化特性發(fā)生變化，進(jìn)而影響魚肉的品質(zhì)和加工性能。
水產(chǎn)品加工預(yù)處理時添加保鮮劑并結(jié)合低溫貯藏是常用的保鮮方式[1,2]。生物保鮮劑因其安全、無毒、可食用的特點被廣泛關(guān)注，國內(nèi)外學(xué)者也針對生物保鮮劑和冰溫貯藏技術(shù)對蛋白質(zhì)功能特性的保護(hù)作用進(jìn)行了探討[3-5]。
但是上述研究在水產(chǎn)品蛋白質(zhì)特性變化方面并不完整，目前尚未見有系統(tǒng)研究蛋白質(zhì)特性的報道。真空浸漬技術(shù)(VacuumImpregnation，VI)能夠影響食品的多孔結(jié)構(gòu)，加速食品基質(zhì)和浸漬溶液之間的雙向傳質(zhì)，從而提高食品浸漬效果和加工效率[6]，目前普遍應(yīng)用于肉類腌制[7-9]和果蔬加工貯藏[10-14]。近年來僅有極少量將VI應(yīng)用于水產(chǎn)品貯藏的研究，其中Zhao等[6]研究發(fā)現(xiàn)，魚膠和葡萄籽提取物聯(lián)合VI有效改善魚片的新鮮度和安全性。
ShiekhKhursheed等[15]采用云樹葉提取物，結(jié)合脈沖電場和VI，有效延長凡納濱對蝦(Penaeusvannamei)的貨架期。目前生物保鮮劑結(jié)合真空浸漬處理方面的研究主要集中在產(chǎn)品的新鮮度，對蛋白質(zhì)的功能特性綜合研究尚未見報道。
本課題組前期對冰溫羅非魚生物保鮮劑進(jìn)行研究[16]，獲得復(fù)合生鮮劑的最佳配比為：海藻酸鈉質(zhì)量濃度為8g/L，Nisin質(zhì)量濃度為0.8g/L，異抗壞血酸鈉質(zhì)量濃度7.5g/L，經(jīng)該生物保鮮劑處理后的羅非魚可將其冰溫(-2℃)貨架期由15d延長至22d。結(jié)合前期研究，本研究擬通過VI輔助生物保鮮劑預(yù)處理對生態(tài)冰溫貯藏期間羅非魚MP生化特性變化影響的探討，了解真空浸漬水產(chǎn)品冰溫貨架期的優(yōu)勢，以期為該技術(shù)的推廣應(yīng)用提供可靠的理論依據(jù)。
1材料與方法
1.1主要材料材料：羅非魚，購于廣東省湛江市湖光市場。試劑：海藻酸鈉，源葉生物有限公司;Nisin，萬利達(dá)生物科技有限公司;異抗壞血酸鈉(異VC鈉)，廣州利源食品添加劑有限公司;Ca2+-ATPpase活性測試盒、蛋白質(zhì)定量測試盒(考馬斯亮藍(lán)法)、總巰基測定試劑盒、羰基含量測試盒，南京建成生物工程研究所;溴酚藍(lán)，天津市化學(xué)試劑研究所。
1.2主要儀器與設(shè)備
真空包裝機(jī)DZ400/2D(瑞利包裝機(jī)械有限公司);紫外分光光度計UV-8000A(上海元析儀器有限公司);真空預(yù)冷試驗機(jī)VCD-02(上海鮮綠真空保鮮設(shè)備有限公司)。
1.3試驗設(shè)計與方法
1.3.1樣品處理
將活魚宰殺，除去頭、尾、表皮及內(nèi)臟，修整成規(guī)格為12cm×5cm×1cm、質(zhì)量為(80±2)g的魚片。將魚片隨機(jī)分成3組：A組魚片使用無菌蒸餾水常壓浸漬27min(對照組);B組魚片使用生物保鮮劑常壓浸漬27min(常壓浸漬組);C組魚片采用生物保鮮劑真空浸漬處理(真空浸漬組，VI組)，真空壓力為0.06MPa，真空浸漬時間為15min，常壓恢復(fù)時間為12min。3組魚片浸漬處理結(jié)束后取出瀝干，真空包裝存放于-2℃環(huán)境中貯藏，每5d對魚片進(jìn)行相關(guān)蛋白指標(biāo)的測定。
1.3.2肌動球蛋白的提取
參照Zhou等[17]的方法測定。準(zhǔn)確稱取絞碎的2g羅非魚肉于燒杯中，隨后加入20mL已預(yù)冷的提取試劑KCl溶液(0.6mol/L，pH7.0)，在冰浴條件下對魚肉進(jìn)行2min均質(zhì)分散，為防止過熱，每均質(zhì)10s停10s。均質(zhì)結(jié)束后溶液進(jìn)行冷卻離心(4℃、10000r/min，30min)，離心完成后收集上清液。
向上清液加入3倍體積已預(yù)冷的蒸餾水，并繼續(xù)按該條件(4℃、10000r/min)離心20min。離心結(jié)束后保留沉淀，然后向沉淀中加入已預(yù)冷20mLKCl溶液(0.6mol/L，pH7.0)，置于4℃環(huán)境中30min。最后在4℃、10000r/min的條件下離心20min，離心后收集的上清液即為肌動球蛋白溶液。
1.3.3鹽溶性的測定參照南京建成蛋白定量測試盒(考馬斯亮藍(lán)法)說明書進(jìn)行測定。
1.3.4Ca2+-ATPase活性的測定參照南京建成公司的ATP酶測試盒說明書進(jìn)行測定。
1.3.5總巰基含量的測定參照南京建成公司蛋白質(zhì)巰基含量測試盒指導(dǎo)方法進(jìn)行。
1.3.6羰基含量測定參照南京建成公司蛋白質(zhì)羰基含量測試盒指導(dǎo)方法進(jìn)行。
1.3.7表面疏水性的測定參照Chelh等[18]的方法進(jìn)行測定表面疏水性。使用20mmol/L，pH6.0的磷酸緩沖液將蛋白樣液的質(zhì)量濃度調(diào)整為5mg/mL，取2mL蛋白樣液和40μL1mg/mL溴酚藍(lán)(BPB)試劑于離心管中，充分振蕩混勻后室溫靜置10min。
然后在4℃，4000r/min條件下冷卻離心15min，取上清液并稀釋10倍后595nm處測定光密度值。把加入40μL1mg/mLBPB試劑的2mL磷酸鹽緩沖液作為空白對照組，使用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行調(diào)零。將結(jié)合態(tài)BPB(μg)作為表面疏水性指數(shù)，按下列公式進(jìn)行計算：溴酚藍(lán)結(jié)合量=200×(空白-樣品)/空白，式中，空白是磷酸鹽緩沖液加入BPB試劑后在595nm處的光密度值;樣品表示蛋白樣液加入BPB試劑后在595nm處的光密度值。
1.4數(shù)據(jù)處理
采用Excel2007進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄和整理，用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，設(shè)置顯著水平為<0.05，使用Origin8.0作圖。試驗結(jié)果均為3次平行試驗平均值。對照組在貯藏20d、常壓浸漬組在貯藏25d后外觀已經(jīng)開始腐敗，無參數(shù)測量的意義。
2結(jié)果與分析
2.1羅非魚片貯藏期間蛋白鹽溶性的變化
隨著貯藏時間延長，三組魚片的肌動球蛋白鹽溶性蛋白含量逐漸下降，說明貯藏過程中肌動球蛋白的構(gòu)象發(fā)生改變導(dǎo)致鹽溶性受到影響[19]。VI組下降幅度最小，對照組在貯藏過程中差異顯著(P<0.055dp>0.05)，但與0d相比，對照組開始出現(xiàn)顯著差異，而常壓浸漬組和VI組變化不明顯。貯藏10d，對照組開始與常壓浸漬組和VI組出現(xiàn)顯著差異(P<0.05)，此時與0d和5d相比常壓浸漬組和VI組鹽溶性顯著降低，但組間沒有差異。這表明生物保鮮劑可以起到抑制肌動球蛋白變性的作用。
魚肉在冰溫貯藏過程中由于微生物大量繁殖使得內(nèi)部微環(huán)境改變，導(dǎo)致不溶性大分子量蛋白質(zhì)聚集體的形成，從而引起蛋白質(zhì)溶解性降低[20]。且貯藏時間的累加會造成蛋白質(zhì)的逐漸變性，分子間疏水性殘基相互交聯(lián)形成不溶性聚集體，蛋白質(zhì)鹽溶性也會下降[21]。VI組和常壓浸漬組魚片鹽溶性下降幅度遠(yuǎn)低于對照組，可能是生物保鮮劑中的海藻酸鈉、異VC鈉有較好的抗氧化性，阻礙蛋白質(zhì)氧化變性進(jìn)程，減慢蛋白質(zhì)鹽溶性的下降速率，這一點與郭利芳等[5]和郭芳等[3]的研究結(jié)論一致。貯藏15d，常壓浸漬組的鹽溶性開始顯著低于VI組(P<0.05)。
隨著時間的推移，貯藏20d與0d相比，VI組、常壓浸漬組和對照組的下降幅度分別為41.49%、45.15%和68.8%，而且VI組在30d的蛋白鹽溶性含量仍在可接受范圍內(nèi)，說明VI處理效果優(yōu)于常壓浸漬處理。這可能是因為真空狀態(tài)和恢復(fù)常壓之間的壓力差，改變了魚肉肌間的間隙分布[7]，促使保鮮劑更有效地滲透到魚肉內(nèi)部，增強(qiáng)其抑制蛋白變性的效果。
羅非魚片貯藏期間Ca2+-ATPase活性的變化，三組羅非魚片在冰溫貯藏過程中Ca2+-ATPase活性呈現(xiàn)下降趨勢。因為魚肉在低溫貯藏過程中發(fā)生pH下降、微生物繁殖、脂肪氧化等變化會破壞蛋白質(zhì)相對的穩(wěn)定體系，從而引起肌球蛋白頭部區(qū)域的構(gòu)象發(fā)生改變，Ca2+不能將變性的肌球蛋白頭部的ATP點位激活，導(dǎo)致Ca2+-ATPase活性下降[22]。但三組羅非魚片在冰溫貯藏過程中Ca2+-ATPase活性下降速度并不相同。相同貯藏時間點，常壓浸漬組和VI組魚片的Ca2+-ATPase活性下降速度均低于對照組，其中VI組下降速度最小。
從10d開始，對照組魚片Ca2+-ATPase活性均顯著低于同貯藏時間的常壓浸漬組和VI組(P<0.05)，這與劉鋒等[4]的研究結(jié)論一致，說明生物保鮮劑可以在一定程度上保護(hù)肌球蛋白的完整性，有效抑制Ca2+-ATPase的活性下降。VI組在貯藏期間，Ca2+-ATPase活性下降平緩，10~20d之間下降不顯著(P>0.05)。20d時與0d相比，對照組、常壓浸漬組和VI組活性分別下降了72.15%、51.19%和39.82%，VI組在30d時魚25d相比Ca2+-ATPase活性變化不顯著(P>0.05)，且比常壓浸漬組25d的含量還高。綜合來看，VI組的保鮮效果最好。
這是因為肌肉中的大部分水分是由毛細(xì)血管力控制的，而毛細(xì)血管力分布在MP內(nèi)部各類蛋白絲排列中，VI作用使蛋白絲之間的間隙增大，有利于保鮮劑進(jìn)入蛋白絲內(nèi)部，而保鮮劑進(jìn)一步改變了蛋白絲上的電荷數(shù)量，導(dǎo)致蛋白絲之間的空間發(fā)生排斥并進(jìn)一步擴(kuò)大[23]，從而使更多的保鮮劑進(jìn)入內(nèi)部，使肌動球蛋白分子的球狀頭部結(jié)構(gòu)的破壞程度小于常壓浸漬組，因此VI處理的魚片保鮮效果優(yōu)于常壓浸漬處理。
2.3羅非魚片貯藏期間總巰基含量的變化
隨著貯藏的進(jìn)行，各組魚片的總巰基含量趨勢線在10d前均呈陡降形式，而在10d后趨勢線變得相對平緩，其中對照組下降程度最劇烈，在整個貯藏過程中均下降顯著(P<0.05);10d時，對照組、常壓浸漬組和VI組間含量差異顯著(<0.05)。
貯藏20d，對照組、常壓浸漬組和VI組總巰基質(zhì)量摩爾濃度分別下降76.63%、58.85%，52.76%，此時對照組魚片已開始出現(xiàn)腐敗跡象，常壓浸漬組和VI組狀態(tài)尚可。在25d，常壓浸漬組與VI組出現(xiàn)顯著差異(P<0.05)，25d之后常壓浸漬組開始出現(xiàn)腐敗跡象，而VI組狀態(tài)尚可。在整個過程中VI組總巰基下降更緩慢，尤其在15d以后，趨勢線比其他兩組更平緩，說明VI處理增強(qiáng)了保鮮效果。
巰基基團(tuán)對于維持MP空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定起著非常重要的作用[24]，由于活性酶參與氧化、冰晶對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞等原因[25]導(dǎo)致低溫貯藏過程中處于魚肉MP的活性巰基暴露出來，被自由基氧化形成二硫鍵-s-s-[26,27]，肌球蛋白的球狀頭部上的巰基發(fā)生氧化使肌球蛋白聚集同時會引起Ca2+-ATPase活性下降[4]，因此本研究中巰基的含量變化與Ca2+-ATPase活性下降情況總體保持一致。
上述結(jié)果表明，生物保鮮劑的強(qiáng)抗氧化能力，能夠抑制MP變性，減少二硫鍵-s-s-的交聯(lián)和肌球蛋白的聚集，減緩魚片巰基的氧化程度，減慢魚片貯藏品質(zhì)劣變進(jìn)程。同時，施加真空使魚片肌肉纖維膨脹，肌肉組織內(nèi)部氣體和部分液體被消除，使接觸面積增大，恢復(fù)大氣壓時，溶液更容易進(jìn)入孔隙，這就是VI作用帶來的壓力梯度變化和毛細(xì)管效應(yīng)，即水動力機(jī)制[28]，其增強(qiáng)了保鮮劑在魚片組織結(jié)構(gòu)中的滲透。VI組的總巰基含量在30d時與25d相比變化不顯著，而且與25d的真空浸漬組數(shù)值接近。
2.4羅非魚片貯藏期間表面疏水性的變化
可以看出在冰溫貯藏過程中，三組魚片的疏水性均呈上升趨勢。對照組的趨勢線上升最快，遠(yuǎn)高于其他兩組，說明未經(jīng)保鮮劑處理的樣品表面疏水性變化很快。這可能是因為生物保鮮劑促進(jìn)蛋白質(zhì)與外部水分子之間的締合作用，疏水性基團(tuán)暴露得較少[29]，溴酚藍(lán)與疏水位點結(jié)合的可能性減小，因而保鮮劑處理的各組魚片溴酚藍(lán)結(jié)合量較低。整個貯藏過程中，對照組的表面疏水性顯著升高(P<0.05)。
貯藏前10d，常壓浸漬組與VI組的溴酚藍(lán)結(jié)合量上升趨勢較為平緩，貯藏10d之后溴酚藍(lán)結(jié)合量加快，趨勢線變陡。在貯藏末期，對照組、常壓浸漬組和VI組溴酚藍(lán)結(jié)合量與初始值相比分別增大了4.58倍、3.22倍和2.17倍，說明貯藏過程中魚片的MP發(fā)生嚴(yán)重的變性而引起構(gòu)象改變，內(nèi)部巰基組分的外露導(dǎo)致二硫鍵-s-s-被進(jìn)一步氧化，產(chǎn)生大量的非二硫鍵和二硫鍵交聯(lián)，蛋白基團(tuán)不斷聚合，進(jìn)一步加劇了疏水基團(tuán)的增長[30]，最終導(dǎo)致MP發(fā)生不可逆的變性[31]。
VI組的疏水性趨勢線較為平緩，VI組30d的疏水性與25d相比差別不顯著(>0.05)，與常壓浸漬組20d的數(shù)值近似。這是因為VI預(yù)處理產(chǎn)生的水動力機(jī)制還伴隨著變形弛豫現(xiàn)象，不僅影響系統(tǒng)的動力和平衡狀態(tài)，而且影響食品組織的物理、機(jī)械和微觀結(jié)構(gòu)特性[28]，進(jìn)一步促進(jìn)了生物保鮮劑在魚片蛋白絲之間的傳遞，有效保護(hù)MP構(gòu)象的完整性，抑制疏水基團(tuán)的增長。
2.5羅非魚片貯藏期間羰基含量的變化
在冰溫貯藏過程中各組羅非魚片羰基含量呈上升趨勢，是因為MP分子中的氨基酸側(cè)鏈被氧化、還原糖發(fā)生非酶糖化應(yīng)、非蛋白糖基化合物結(jié)合和多肽鏈的氧化斷裂[32-34]等多種因素導(dǎo)致羰基的不斷產(chǎn)生。對照組羰基含量始終高于常壓浸漬組和VI組，說明未經(jīng)任何處理的魚片MP氧化進(jìn)程很快。其中常壓浸漬組在5d之后、VI組在15d之后趨勢線才變陡，VI組和常壓浸漬組之間在20d才開始出現(xiàn)顯著差異(P<0.05)。
這表明生物保鮮劑可顯著延緩MP的氧化進(jìn)程，生物保鮮劑中的活性成分具有很好的抗菌作用[16]，能夠抑制氨基酸側(cè)鏈的氧化，一定程度上抑制肽鏈的氧化斷裂。VI組魚片羰基含量增加緩慢，在30d時，其羰基含量與25d差異不大，均小于常壓浸漬組20d的含量。這是因為VI預(yù)處理可以使外部溶液通過的孔隙以快速、可控、均勻的方式直接進(jìn)入食品組織內(nèi)部，而不破壞原有的結(jié)構(gòu)[23]，一方面使保鮮劑在魚片表面形成保護(hù)薄膜，另一方面能通過制造真空狀態(tài)而改善肌肉內(nèi)部孔隙結(jié)構(gòu)、真空-恢復(fù)常壓帶來的壓力變化而產(chǎn)生的震動進(jìn)一步增強(qiáng)了的水動力滲透機(jī)制[7]，使生物保鮮劑更好地滲透到魚片內(nèi)部，增強(qiáng)保鮮效果，因而VI處理組魚肉氧化變性程度最低。
3結(jié)論
1)冰溫貯藏過程中，經(jīng)生物保鮮劑處理的魚片MP各生化指標(biāo)變化幅度均低于對照組，其中及以后的蛋白鹽溶性、總巰基含量和羰基含量在貯藏10d開始、Ca2+-ATPase活性和表面疏水性在貯藏5d開始與對照組有顯著差異(P<0.05)，表明生物保鮮劑能有效保護(hù)羅非魚片MP構(gòu)象的完整性，延緩魚肉腐敗變質(zhì)進(jìn)程。
2)相比常壓浸漬組，VI組的魚片MP變性程度更低。VI組羅非魚片冰溫貯藏25~30d時各MP指標(biāo)差異不大(P>0.05)，其中羰基、總巰基含量低于常壓浸漬組20d時的含量，表面疏水性與常壓浸漬組20d數(shù)值接近，蛋白鹽溶性和Ca2+-ATPase活性高于常壓浸漬組25d，使VI組保質(zhì)期延長到30d，比單獨使用生物保鮮劑增加8d，說明VI預(yù)處理能使生物保鮮劑有效地滲入到魚片內(nèi)部，使得生物保鮮劑抑制MP變性的作用增強(qiáng)，有效延長冰溫羅非魚貯藏期。
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作者：劉巖1，李敏1，金枝2，羅靜2，張瑩2，張乾熙1，阮健文1，葉彪1，關(guān)志強(qiáng)1
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