摘要:【目的】通過(guò)肌原纖維蛋白生化特性的變化,考察生物保鮮劑結(jié)合真空浸漬處理在羅非魚(yú)冰溫貯藏中的應(yīng)用效果。【方法】分別將羅非魚(yú)片進(jìn)行蒸餾水常壓浸漬(對(duì)照組)、生物保鮮劑常壓浸漬、生物保鮮劑真空浸漬處理,后測(cè)定冰溫保藏過(guò)程中肌原纖維蛋白的鹽溶性、Ca2+-ATPase酶活性、總巰基含量、表面疏水性和羰基含量。【結(jié)果】與對(duì)照組對(duì)比,生物保鮮劑處理常壓浸漬和真空浸漬組冰溫貯藏5d后的表面疏水性、Ca2+-ATPase酶活性,10d后的肌動(dòng)球蛋白的鹽溶性、總巰基含量和羰基含量與對(duì)照組出現(xiàn)顯著差異(<0.05),而VI浸漬和常壓浸漬組之間此時(shí)的相應(yīng)指標(biāo)對(duì)比并無(wú)顯著差異(>0.05);真空浸漬組在10d表面疏水性、Ca2+-ATPase酶活性、總巰基含量,15d的肌動(dòng)球蛋白的鹽溶性、20d羰基含量與常壓浸漬組出現(xiàn)顯著差異(<0.05)。在貯藏期間,對(duì)照組的各肌原纖維蛋白(MP)相關(guān)指標(biāo)變化顯著,VI組各指標(biāo)在30d的貯藏時(shí)間內(nèi)變化最平緩。真空浸漬結(jié)合生物保鮮劑處理能使冰溫羅非魚(yú)的貯藏期延長(zhǎng)到30d。【結(jié)論】生物保鮮劑結(jié)合真空浸漬預(yù)處理工藝能進(jìn)一步保護(hù)肌原纖維蛋白構(gòu)象的完整性,延緩蛋白質(zhì)氧化進(jìn)程,改善羅非魚(yú)片在冰溫貨架期的品質(zhì)。
關(guān)鍵詞:真空浸漬;生物保鮮劑;冰溫;羅非魚(yú);肌原纖維蛋白
羅非魚(yú)(Oreochromisniloticus)蛋白質(zhì)含量高,在貯藏與運(yùn)輸過(guò)程中易受自身內(nèi)源酶和微生物生長(zhǎng)繁殖及氧化作用等影響,導(dǎo)致肌原纖維蛋白(MP)的鹽溶性、Ca2+-ATPase酶活性、總巰基含量、羰基含量以及表面疏水性等生化特性發(fā)生變化,進(jìn)而影響魚(yú)肉的品質(zhì)和加工性能。
水產(chǎn)品加工預(yù)處理時(shí)添加保鮮劑并結(jié)合低溫貯藏是常用的保鮮方式[1,2]。生物保鮮劑因其安全、無(wú)毒、可食用的特點(diǎn)被廣泛關(guān)注,國(guó)內(nèi)外學(xué)者也針對(duì)生物保鮮劑和冰溫貯藏技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)功能特性的保護(hù)作用進(jìn)行了探討[3-5]。
但是上述研究在水產(chǎn)品蛋白質(zhì)特性變化方面并不完整,目前尚未見(jiàn)有系統(tǒng)研究蛋白質(zhì)特性的報(bào)道。真空浸漬技術(shù)(VacuumImpregnation,VI)能夠影響食品的多孔結(jié)構(gòu),加速食品基質(zhì)和浸漬溶液之間的雙向傳質(zhì),從而提高食品浸漬效果和加工效率[6],目前普遍應(yīng)用于肉類腌制[7-9]和果蔬加工貯藏[10-14]。近年來(lái)僅有極少量將VI應(yīng)用于水產(chǎn)品貯藏的研究,其中Zhao等[6]研究發(fā)現(xiàn),魚(yú)膠和葡萄籽提取物聯(lián)合VI有效改善魚(yú)片的新鮮度和安全性。
ShiekhKhursheed等[15]采用云樹(shù)葉提取物,結(jié)合脈沖電場(chǎng)和VI,有效延長(zhǎng)凡納濱對(duì)蝦(Penaeusvannamei)的貨架期。目前生物保鮮劑結(jié)合真空浸漬處理方面的研究主要集中在產(chǎn)品的新鮮度,對(duì)蛋白質(zhì)的功能特性綜合研究尚未見(jiàn)報(bào)道。
本課題組前期對(duì)冰溫羅非魚(yú)生物保鮮劑進(jìn)行研究[16],獲得復(fù)合生鮮劑的最佳配比為:海藻酸鈉質(zhì)量濃度為8g/L,Nisin質(zhì)量濃度為0.8g/L,異抗壞血酸鈉質(zhì)量濃度7.5g/L,經(jīng)該生物保鮮劑處理后的羅非魚(yú)可將其冰溫(-2℃)貨架期由15d延長(zhǎng)至22d。結(jié)合前期研究,本研究擬通過(guò)VI輔助生物保鮮劑預(yù)處理對(duì)生態(tài)冰溫貯藏期間羅非魚(yú)MP生化特性變化影響的探討,了解真空浸漬水產(chǎn)品冰溫貨架期的優(yōu)勢(shì),以期為該技術(shù)的推廣應(yīng)用提供可靠的理論依據(jù)。
1材料與方法
1.1主要材料材料:羅非魚(yú),購(gòu)于廣東省湛江市湖光市場(chǎng)。試劑:海藻酸鈉,源葉生物有限公司;Nisin,萬(wàn)利達(dá)生物科技有限公司;異抗壞血酸鈉(異VC鈉),廣州利源食品添加劑有限公司;Ca2+-ATPpase活性測(cè)試盒、蛋白質(zhì)定量測(cè)試盒(考馬斯亮藍(lán)法)、總巰基測(cè)定試劑盒、羰基含量測(cè)試盒,南京建成生物工程研究所;溴酚藍(lán),天津市化學(xué)試劑研究所。
1.2主要儀器與設(shè)備
真空包裝機(jī)DZ400/2D(瑞利包裝機(jī)械有限公司);紫外分光光度計(jì)UV-8000A(上海元析儀器有限公司);真空預(yù)冷試驗(yàn)機(jī)VCD-02(上海鮮綠真空保鮮設(shè)備有限公司)。
1.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法
1.3.1樣品處理
將活魚(yú)宰殺,除去頭、尾、表皮及內(nèi)臟,修整成規(guī)格為12cm×5cm×1cm、質(zhì)量為(80±2)g的魚(yú)片。將魚(yú)片隨機(jī)分成3組:A組魚(yú)片使用無(wú)菌蒸餾水常壓浸漬27min(對(duì)照組);B組魚(yú)片使用生物保鮮劑常壓浸漬27min(常壓浸漬組);C組魚(yú)片采用生物保鮮劑真空浸漬處理(真空浸漬組,VI組),真空壓力為0.06MPa,真空浸漬時(shí)間為15min,常壓恢復(fù)時(shí)間為12min。3組魚(yú)片浸漬處理結(jié)束后取出瀝干,真空包裝存放于-2℃環(huán)境中貯藏,每5d對(duì)魚(yú)片進(jìn)行相關(guān)蛋白指標(biāo)的測(cè)定。
1.3.2肌動(dòng)球蛋白的提取
參照Z(yǔ)hou等[17]的方法測(cè)定。準(zhǔn)確稱取絞碎的2g羅非魚(yú)肉于燒杯中,隨后加入20mL已預(yù)冷的提取試劑KCl溶液(0.6mol/L,pH7.0),在冰浴條件下對(duì)魚(yú)肉進(jìn)行2min均質(zhì)分散,為防止過(guò)熱,每均質(zhì)10s停10s。均質(zhì)結(jié)束后溶液進(jìn)行冷卻離心(4℃、10000r/min,30min),離心完成后收集上清液。
向上清液加入3倍體積已預(yù)冷的蒸餾水,并繼續(xù)按該條件(4℃、10000r/min)離心20min。離心結(jié)束后保留沉淀,然后向沉淀中加入已預(yù)冷20mLKCl溶液(0.6mol/L,pH7.0),置于4℃環(huán)境中30min。最后在4℃、10000r/min的條件下離心20min,離心后收集的上清液即為肌動(dòng)球蛋白溶液。
1.3.3鹽溶性的測(cè)定參照南京建成蛋白定量測(cè)試盒(考馬斯亮藍(lán)法)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。
1.3.4Ca2+-ATPase活性的測(cè)定參照南京建成公司的ATP酶測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。
1.3.5總巰基含量的測(cè)定參照南京建成公司蛋白質(zhì)巰基含量測(cè)試盒指導(dǎo)方法進(jìn)行。
1.3.6羰基含量測(cè)定參照南京建成公司蛋白質(zhì)羰基含量測(cè)試盒指導(dǎo)方法進(jìn)行。
1.3.7表面疏水性的測(cè)定參照Chelh等[18]的方法進(jìn)行測(cè)定表面疏水性。使用20mmol/L,pH6.0的磷酸緩沖液將蛋白樣液的質(zhì)量濃度調(diào)整為5mg/mL,取2mL蛋白樣液和40μL1mg/mL溴酚藍(lán)(BPB)試劑于離心管中,充分振蕩混勻后室溫靜置10min。
然后在4℃,4000r/min條件下冷卻離心15min,取上清液并稀釋10倍后595nm處測(cè)定光密度值。把加入40μL1mg/mLBPB試劑的2mL磷酸鹽緩沖液作為空白對(duì)照組,使用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行調(diào)零。將結(jié)合態(tài)BPB(μg)作為表面疏水性指數(shù),按下列公式進(jìn)行計(jì)算:溴酚藍(lán)結(jié)合量=200×(空白-樣品)/空白,式中,空白是磷酸鹽緩沖液加入BPB試劑后在595nm處的光密度值;樣品表示蛋白樣液加入BPB試劑后在595nm處的光密度值。
1.4數(shù)據(jù)處理
采用Excel2007進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄和整理,用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,設(shè)置顯著水平為<0.05,使用Origin8.0作圖。試驗(yàn)結(jié)果均為3次平行試驗(yàn)平均值。對(duì)照組在貯藏20d、常壓浸漬組在貯藏25d后外觀已經(jīng)開(kāi)始腐敗,無(wú)參數(shù)測(cè)量的意義。
2結(jié)果與分析
2.1羅非魚(yú)片貯藏期間蛋白鹽溶性的變化
隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng),三組魚(yú)片的肌動(dòng)球蛋白鹽溶性蛋白含量逐漸下降,說(shuō)明貯藏過(guò)程中肌動(dòng)球蛋白的構(gòu)象發(fā)生改變導(dǎo)致鹽溶性受到影響[19]。VI組下降幅度最小,對(duì)照組在貯藏過(guò)程中差異顯著(P<0.055dp>0.05),但與0d相比,對(duì)照組開(kāi)始出現(xiàn)顯著差異,而常壓浸漬組和VI組變化不明顯。貯藏10d,對(duì)照組開(kāi)始與常壓浸漬組和VI組出現(xiàn)顯著差異(P<0.05),此時(shí)與0d和5d相比常壓浸漬組和VI組鹽溶性顯著降低,但組間沒(méi)有差異。這表明生物保鮮劑可以起到抑制肌動(dòng)球蛋白變性的作用。
魚(yú)肉在冰溫貯藏過(guò)程中由于微生物大量繁殖使得內(nèi)部微環(huán)境改變,導(dǎo)致不溶性大分子量蛋白質(zhì)聚集體的形成,從而引起蛋白質(zhì)溶解性降低[20]。且貯藏時(shí)間的累加會(huì)造成蛋白質(zhì)的逐漸變性,分子間疏水性殘基相互交聯(lián)形成不溶性聚集體,蛋白質(zhì)鹽溶性也會(huì)下降[21]。VI組和常壓浸漬組魚(yú)片鹽溶性下降幅度遠(yuǎn)低于對(duì)照組,可能是生物保鮮劑中的海藻酸鈉、異VC鈉有較好的抗氧化性,阻礙蛋白質(zhì)氧化變性進(jìn)程,減慢蛋白質(zhì)鹽溶性的下降速率,這一點(diǎn)與郭利芳等[5]和郭芳等[3]的研究結(jié)論一致。貯藏15d,常壓浸漬組的鹽溶性開(kāi)始顯著低于VI組(P<0.05)。
隨著時(shí)間的推移,貯藏20d與0d相比,VI組、常壓浸漬組和對(duì)照組的下降幅度分別為41.49%、45.15%和68.8%,而且VI組在30d的蛋白鹽溶性含量仍在可接受范圍內(nèi),說(shuō)明VI處理效果優(yōu)于常壓浸漬處理。這可能是因?yàn)檎婵諣顟B(tài)和恢復(fù)常壓之間的壓力差,改變了魚(yú)肉肌間的間隙分布[7],促使保鮮劑更有效地滲透到魚(yú)肉內(nèi)部,增強(qiáng)其抑制蛋白變性的效果。
羅非魚(yú)片貯藏期間Ca2+-ATPase活性的變化,三組羅非魚(yú)片在冰溫貯藏過(guò)程中Ca2+-ATPase活性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。因?yàn)轸~(yú)肉在低溫貯藏過(guò)程中發(fā)生pH下降、微生物繁殖、脂肪氧化等變化會(huì)破壞蛋白質(zhì)相對(duì)的穩(wěn)定體系,從而引起肌球蛋白頭部區(qū)域的構(gòu)象發(fā)生改變,Ca2+不能將變性的肌球蛋白頭部的ATP點(diǎn)位激活,導(dǎo)致Ca2+-ATPase活性下降[22]。但三組羅非魚(yú)片在冰溫貯藏過(guò)程中Ca2+-ATPase活性下降速度并不相同。相同貯藏時(shí)間點(diǎn),常壓浸漬組和VI組魚(yú)片的Ca2+-ATPase活性下降速度均低于對(duì)照組,其中VI組下降速度最小。
從10d開(kāi)始,對(duì)照組魚(yú)片Ca2+-ATPase活性均顯著低于同貯藏時(shí)間的常壓浸漬組和VI組(P<0.05),這與劉鋒等[4]的研究結(jié)論一致,說(shuō)明生物保鮮劑可以在一定程度上保護(hù)肌球蛋白的完整性,有效抑制Ca2+-ATPase的活性下降。VI組在貯藏期間,Ca2+-ATPase活性下降平緩,10~20d之間下降不顯著(P>0.05)。20d時(shí)與0d相比,對(duì)照組、常壓浸漬組和VI組活性分別下降了72.15%、51.19%和39.82%,VI組在30d時(shí)魚(yú)25d相比Ca2+-ATPase活性變化不顯著(P>0.05),且比常壓浸漬組25d的含量還高。綜合來(lái)看,VI組的保鮮效果最好。
這是因?yàn)榧∪庵械拇蟛糠炙质怯擅?xì)血管力控制的,而毛細(xì)血管力分布在MP內(nèi)部各類蛋白絲排列中,VI作用使蛋白絲之間的間隙增大,有利于保鮮劑進(jìn)入蛋白絲內(nèi)部,而保鮮劑進(jìn)一步改變了蛋白絲上的電荷數(shù)量,導(dǎo)致蛋白絲之間的空間發(fā)生排斥并進(jìn)一步擴(kuò)大[23],從而使更多的保鮮劑進(jìn)入內(nèi)部,使肌動(dòng)球蛋白分子的球狀頭部結(jié)構(gòu)的破壞程度小于常壓浸漬組,因此VI處理的魚(yú)片保鮮效果優(yōu)于常壓浸漬處理。
2.3羅非魚(yú)片貯藏期間總巰基含量的變化
隨著貯藏的進(jìn)行,各組魚(yú)片的總巰基含量趨勢(shì)線在10d前均呈陡降形式,而在10d后趨勢(shì)線變得相對(duì)平緩,其中對(duì)照組下降程度最劇烈,在整個(gè)貯藏過(guò)程中均下降顯著(P<0.05);10d時(shí),對(duì)照組、常壓浸漬組和VI組間含量差異顯著(<0.05)。
貯藏20d,對(duì)照組、常壓浸漬組和VI組總巰基質(zhì)量摩爾濃度分別下降76.63%、58.85%,52.76%,此時(shí)對(duì)照組魚(yú)片已開(kāi)始出現(xiàn)腐敗跡象,常壓浸漬組和VI組狀態(tài)尚可。在25d,常壓浸漬組與VI組出現(xiàn)顯著差異(P<0.05),25d之后常壓浸漬組開(kāi)始出現(xiàn)腐敗跡象,而VI組狀態(tài)尚可。在整個(gè)過(guò)程中VI組總巰基下降更緩慢,尤其在15d以后,趨勢(shì)線比其他兩組更平緩,說(shuō)明VI處理增強(qiáng)了保鮮效果。
巰基基團(tuán)對(duì)于維持MP空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定起著非常重要的作用[24],由于活性酶參與氧化、冰晶對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞等原因[25]導(dǎo)致低溫貯藏過(guò)程中處于魚(yú)肉MP的活性巰基暴露出來(lái),被自由基氧化形成二硫鍵-s-s-[26,27],肌球蛋白的球狀頭部上的巰基發(fā)生氧化使肌球蛋白聚集同時(shí)會(huì)引起Ca2+-ATPase活性下降[4],因此本研究中巰基的含量變化與Ca2+-ATPase活性下降情況總體保持一致。
上述結(jié)果表明,生物保鮮劑的強(qiáng)抗氧化能力,能夠抑制MP變性,減少二硫鍵-s-s-的交聯(lián)和肌球蛋白的聚集,減緩魚(yú)片巰基的氧化程度,減慢魚(yú)片貯藏品質(zhì)劣變進(jìn)程。同時(shí),施加真空使魚(yú)片肌肉纖維膨脹,肌肉組織內(nèi)部氣體和部分液體被消除,使接觸面積增大,恢復(fù)大氣壓時(shí),溶液更容易進(jìn)入孔隙,這就是VI作用帶來(lái)的壓力梯度變化和毛細(xì)管效應(yīng),即水動(dòng)力機(jī)制[28],其增強(qiáng)了保鮮劑在魚(yú)片組織結(jié)構(gòu)中的滲透。VI組的總巰基含量在30d時(shí)與25d相比變化不顯著,而且與25d的真空浸漬組數(shù)值接近。
2.4羅非魚(yú)片貯藏期間表面疏水性的變化
可以看出在冰溫貯藏過(guò)程中,三組魚(yú)片的疏水性均呈上升趨勢(shì)。對(duì)照組的趨勢(shì)線上升最快,遠(yuǎn)高于其他兩組,說(shuō)明未經(jīng)保鮮劑處理的樣品表面疏水性變化很快。這可能是因?yàn)樯锉ur劑促進(jìn)蛋白質(zhì)與外部水分子之間的締合作用,疏水性基團(tuán)暴露得較少[29],溴酚藍(lán)與疏水位點(diǎn)結(jié)合的可能性減小,因而保鮮劑處理的各組魚(yú)片溴酚藍(lán)結(jié)合量較低。整個(gè)貯藏過(guò)程中,對(duì)照組的表面疏水性顯著升高(P<0.05)。
貯藏前10d,常壓浸漬組與VI組的溴酚藍(lán)結(jié)合量上升趨勢(shì)較為平緩,貯藏10d之后溴酚藍(lán)結(jié)合量加快,趨勢(shì)線變陡。在貯藏末期,對(duì)照組、常壓浸漬組和VI組溴酚藍(lán)結(jié)合量與初始值相比分別增大了4.58倍、3.22倍和2.17倍,說(shuō)明貯藏過(guò)程中魚(yú)片的MP發(fā)生嚴(yán)重的變性而引起構(gòu)象改變,內(nèi)部巰基組分的外露導(dǎo)致二硫鍵-s-s-被進(jìn)一步氧化,產(chǎn)生大量的非二硫鍵和二硫鍵交聯(lián),蛋白基團(tuán)不斷聚合,進(jìn)一步加劇了疏水基團(tuán)的增長(zhǎng)[30],最終導(dǎo)致MP發(fā)生不可逆的變性[31]。
VI組的疏水性趨勢(shì)線較為平緩,VI組30d的疏水性與25d相比差別不顯著(>0.05),與常壓浸漬組20d的數(shù)值近似。這是因?yàn)閂I預(yù)處理產(chǎn)生的水動(dòng)力機(jī)制還伴隨著變形弛豫現(xiàn)象,不僅影響系統(tǒng)的動(dòng)力和平衡狀態(tài),而且影響食品組織的物理、機(jī)械和微觀結(jié)構(gòu)特性[28],進(jìn)一步促進(jìn)了生物保鮮劑在魚(yú)片蛋白絲之間的傳遞,有效保護(hù)MP構(gòu)象的完整性,抑制疏水基團(tuán)的增長(zhǎng)。
2.5羅非魚(yú)片貯藏期間羰基含量的變化
在冰溫貯藏過(guò)程中各組羅非魚(yú)片羰基含量呈上升趨勢(shì),是因?yàn)镸P分子中的氨基酸側(cè)鏈被氧化、還原糖發(fā)生非酶糖化應(yīng)、非蛋白糖基化合物結(jié)合和多肽鏈的氧化斷裂[32-34]等多種因素導(dǎo)致羰基的不斷產(chǎn)生。對(duì)照組羰基含量始終高于常壓浸漬組和VI組,說(shuō)明未經(jīng)任何處理的魚(yú)片MP氧化進(jìn)程很快。其中常壓浸漬組在5d之后、VI組在15d之后趨勢(shì)線才變陡,VI組和常壓浸漬組之間在20d才開(kāi)始出現(xiàn)顯著差異(P<0.05)。
這表明生物保鮮劑可顯著延緩MP的氧化進(jìn)程,生物保鮮劑中的活性成分具有很好的抗菌作用[16],能夠抑制氨基酸側(cè)鏈的氧化,一定程度上抑制肽鏈的氧化斷裂。VI組魚(yú)片羰基含量增加緩慢,在30d時(shí),其羰基含量與25d差異不大,均小于常壓浸漬組20d的含量。這是因?yàn)閂I預(yù)處理可以使外部溶液通過(guò)的孔隙以快速、可控、均勻的方式直接進(jìn)入食品組織內(nèi)部,而不破壞原有的結(jié)構(gòu)[23],一方面使保鮮劑在魚(yú)片表面形成保護(hù)薄膜,另一方面能通過(guò)制造真空狀態(tài)而改善肌肉內(nèi)部孔隙結(jié)構(gòu)、真空-恢復(fù)常壓帶來(lái)的壓力變化而產(chǎn)生的震動(dòng)進(jìn)一步增強(qiáng)了的水動(dòng)力滲透機(jī)制[7],使生物保鮮劑更好地滲透到魚(yú)片內(nèi)部,增強(qiáng)保鮮效果,因而VI處理組魚(yú)肉氧化變性程度最低。
3結(jié)論
1)冰溫貯藏過(guò)程中,經(jīng)生物保鮮劑處理的魚(yú)片MP各生化指標(biāo)變化幅度均低于對(duì)照組,其中及以后的蛋白鹽溶性、總巰基含量和羰基含量在貯藏10d開(kāi)始、Ca2+-ATPase活性和表面疏水性在貯藏5d開(kāi)始與對(duì)照組有顯著差異(P<0.05),表明生物保鮮劑能有效保護(hù)羅非魚(yú)片MP構(gòu)象的完整性,延緩魚(yú)肉腐敗變質(zhì)進(jìn)程。
2)相比常壓浸漬組,VI組的魚(yú)片MP變性程度更低。VI組羅非魚(yú)片冰溫貯藏25~30d時(shí)各MP指標(biāo)差異不大(P>0.05),其中羰基、總巰基含量低于常壓浸漬組20d時(shí)的含量,表面疏水性與常壓浸漬組20d數(shù)值接近,蛋白鹽溶性和Ca2+-ATPase活性高于常壓浸漬組25d,使VI組保質(zhì)期延長(zhǎng)到30d,比單獨(dú)使用生物保鮮劑增加8d,說(shuō)明VI預(yù)處理能使生物保鮮劑有效地滲入到魚(yú)片內(nèi)部,使得生物保鮮劑抑制MP變性的作用增強(qiáng),有效延長(zhǎng)冰溫羅非魚(yú)貯藏期。
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作者:劉巖1,李敏1,金枝2,羅靜2,張瑩2,張乾熙1,阮健文1,葉彪1,關(guān)志強(qiáng)1
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