14次 摘要：為探究PPAR與c/EBP基因在蘇太豬不同組織中的表達與脂肪沉積的關系,本實驗以10月齡蘇太豬為研究對象,運用實時熒光定量PCR (q RT-PCR)技術檢測PPAR與c/EBP基因mRNA在蘇太豬心、肝、脾、肺、腎、胃、背最長肌和皮下脂肪8個組織中的表達水平。結果表明,PPA --> 摘要：為探究PPARγ與c/EBPα基因在蘇太豬不同組織中的表達與脂肪沉積的關系,本實驗以10月齡蘇太豬為研究對象,運用實時熒光定量PCR (q RT-PCR)技術檢測PPARγ與c/EBPα基因mRNA在蘇太豬心、肝、脾、肺、腎、胃、背最長肌和皮下脂肪8個組織中的表達水平。結果表明,PPARγ與c/EBPα基因在蘇太豬的8個組織中均有不同程度的表達,其中,PPARγ基因在蘇太豬脾臟組織中的表達量最高,皮下脂肪中的表達水平僅次于脾;以背最長肌中PPARγ基因的相對表達量作對比,背最長肌與脾、肺和皮下脂肪的相對表達差異極顯著(p<0.01),其余為差異不顯著(p>0.05),表達量高低順序為脾>皮下脂肪>肺>心>胃>腎>肝>背最長肌;c/EBPα基因在蘇太豬的皮下脂肪的表達量最高,以背最長肌中c/EBPα基因的相對表達量作對比,在肝、脾、皮下脂肪組織中表達差異極顯著(p<0.01),肺的相對表達差異顯著(p<0.05),其余組織中差異不顯著(p>0.05),表達量的高低順序為皮下脂肪>肝>脾>肺>腎>心>胃>背最長肌。兩基因在各組織中表達趨勢趨于一致。試驗結果表明PPARγ和c/EBPα基因可能對豬脂肪沉積有重要影響。 關鍵詞：蘇太豬; PPARγ; c/EBPα; RT-PCR; 表達量; 蘇太豬是以中國太湖豬為基礎母本與杜洛克經過多年的雜交選育而來，屬于瘦肉型豬種(華金弟等,2003)，既有太湖豬的高繁殖性能，又有杜洛克、長白豬和大白豬瘦肉率高的優點(徐朵燕,2012)。本試驗以脂肪沉積相關基因PPARγ與c/EBPα為候選基因，研究蘇太豬不同組織中PPARγ與c/EBPα基因mRNA的表達水平。近年來的研究表明脂肪沉積對肉品質的影響突出，而肌內脂肪(intramuscular fat,IMF)含量是影響肉品質的主要因素，與肉的風味、嫩度、營養價值等肉質性能相關(王怡平等,2017)，且IMF的含量與肉質性狀表現為正相關(宋代軍,2014)，因此，探究PPARγ與c/EBPα基因在蘇太豬中不同組織的表達規律，對蘇太豬肉質性狀的研究具有重要意義。 過氧化物酶體增殖物活化受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ)具有調節脂肪形成、糖脂代謝和細胞增殖分化等生物學功能(White and Stephens,2010)。PPARγ是核內受體轉錄因子超家族成員之一，核內受體轉錄因子超家族成員(PPARs)包括α、β和γ3種亞型，各自由不同的基因編碼，PPARs能促進脂質的合成，在許多組織中均有表達(Yan et al.,2015)，而在這幾個亞型中PPARγ在脂肪代謝過程中作用更明顯(林婄婄等,2012)。研究證明PPARγ在脂肪細胞分化中起重要作用，是脂肪組織生長發育的主要調控及轉錄因子，其信號通路可直接影響脂質代謝(Tontonoz et al.,1994)。Adams等(1997)研究發現PPARγ的表達量與脂肪生成在早期呈正相關變化。高霞等(2017)通過誘導豬DFAI細胞成脂再分化并檢測過程中PPARγ的表達，經研究發現隨著誘導時間增加，脂滴數量增多，體積增大，PPPARγmRNA的表達量也隨著誘導時間的增加而上升。CCAAT/增強子結合蛋白α(CCAAT/enhancer binding protein alpha,c/EBPα)是堿性亮氨酸拉鏈蛋白家族的一員，堿性亮氨酸拉鏈蛋白家族是一類在前脂肪細胞分化過程中起關鍵作用的轉錄因子之一(于莎莉等,2011)，它有6種同分異構體，分別為c/EBPα、c/EBPβ、C/EBPδ、c/EBPγ、c/EBPε和c/EBPζ，且c/EBPα在脂肪細胞分化、發育過程中起著關鍵性作用，可以激活一些脂肪細胞分化相關基因的轉錄和表達(皇甫一凡,2013;盤道興等,2017)。CCAAT增強子結合蛋白家族中c/EBPα蛋白是第一個被證明在脂肪細胞分化過程中起重要作用的蛋白(王啟貴等,2006)。有研究指出c/EBPα缺陷的小鼠出生后不久便因為低血糖死亡，經檢測得出脂肪組織中脂質的積累顯著地降低(Wang et al.,1995)。 在激素核受體超家族成員中PPARγ最具脂肪組織特異性，對脂肪細胞的分化起著重要的作用。而在c/EBP家族中，c/EBPα可促進PPARγ的高表達，保持分化細胞的表型，在脂肪細胞的分化過程中起著關鍵性的作用，說明c/EBPα與PPARγ存在著相互作用(劉毅等,2008)。有研究表明，外源表達PPARγ與c/EBPα基因能將體外培養的成肌細胞轉化為脂肪細胞(姜美華等,2013)。因此，PPARγ與c/EBPα基因可作為研究脂肪在豬的不同組織表達水平的候選基因。本試驗通過qRT-PCR技術對PPARγ基因與c/EBPα基因m RNA在蘇太豬的心、肝、脾、肺、腎等8個不同組織的表達水平進行測定分析，以探究PPARγ與c/EBPα基因在蘇太豬脂肪沉積的影響，為進一步研究蘇太豬脂肪沉積相關基因提供基礎參考。 1 結果與分析 1.1 引物擴增產物的檢測 目標基因(PPARγ,c/EBPα)和內參基因(GAPDH)通過普通PCR擴增獲得。再用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測得到的擴增產物(圖1)，結果可見產物特異性強，未發現有引物二聚體，且擴增片段與目的片段大小一致，可用于下一步試驗。 1.2 qRT-PCR的擴增曲線和溶解曲線 從熒光定量PCR反應后得到的擴增曲線和溶解曲線可以看出(圖2;圖3)，基因在不同組織中擴增曲線呈現完好的“S”形狀。循環閾值(CT)處于擴增曲線的對數期，大小適當，從溶解曲線可看出c/EBPα與PPARγ基因均表現為單峰，無其他非特異性擴增產物和引物二聚體，表明定量試驗結果準確可靠，符合試驗要求。 圖1 PPARγ,c/EBPα,GAPDH凝膠電泳分析 Figure 1 Gel electrophoresis analysis of PPARγ,c/EBPαand GAPDH 注:A:PPARγ;B:c/EBPα;C:GAPDH;M:Marker 1 000 1.3 PPARγ和c/EBPα基因在蘇太豬不同組織中的表達情況分析 用qRT-PCR技術對心、肝、脾、肺等8個組織中PPARγ、c/EBPα基因mRNA進行表達量水平分析，用內參基因進行均一化處理。結果顯示，PPARγ基因與c/EBPα基因在8個組織中均有表達，PPARγ基因在脾臟組織中的表達量最高，背最長肌中表達量最低，不同組織中的表達量高低順序為脾>皮下脂肪>肺>心>胃>腎>肝>背最長肌；而c/EBPα基因在8個組織中皮下脂肪的表達量最高，背最長肌為最低，其表達量的高低順序為皮下脂肪>肝>脾>肺>腎>心>胃>背最長肌(圖4;圖5)。 圖2 PPARγ基因擴增曲線和溶解曲線 Figure 2 Amplification and dissolution curve of PPARγgene 圖3 c/EBPα基因擴增曲線和溶解曲線 Figure 3 Amplification and dissolution curve of c/EBPαgene 2 討論 隨著生活水平的提高，人們對肉的風味與品質方面也更加關注。本試驗以脂肪相關基因PPARγ和c/EBPα為候選基因，探究PPARγ和c/EBPα基因在蘇太豬的不同組織中表達水平。杜琛等(2016)通過PPARγ-shRNA慢病毒感染脂肪細胞后，在蛋白水平抑制PPARγ的表達，得出PPARγ基因有促進絨山羊肌內前脂肪細胞分化作用。龔蘭等(2011)研究表明，PPARγ可在骨骼肌細胞上有效表達并與IMF代謝呈一定關聯，PPARγ基因在豬骨骼肌細胞中有較高表達且與脂肪合成有正相關。韋璇等(2014)研究得出c/EBPα在脂尾型的羊和灘羊、肥臀型的哈薩克羊尾部脂肪組織中的mRNA表達水平較高，而在瘦尾型的陜北細毛羊、西藏羊尾部脂肪組織中表達水平相對較低，可知c/EBPα基因與脂肪的形成存在關聯。武春艷等(2014)研究轉錄因子互作調控雞脂肪細胞分化，發現c/EBPα基因過表達促進PPARγ基因的啟動子活性。宋新磊等(2008)研究發現c/EBPα與協同PPARγ作用影響脂肪細胞的分化。陳勝鋒等(2007)對原代培養大鼠脂肪前體細胞分化過程中PPARγ和c/EBPαmRNA的表達研究得出，在不同的時期PPARγ和c/EBPαmRNA的表達量不同，但到了一定時期后兩者表現為協同作用，共同維持脂肪細胞增值及分化，直至脂肪細胞成熟。試驗結果表明c/EBPα和PPARγ基因的相對表達量在背最長肌均為最低，在皮下脂肪中的相對表達量較高。PPARγ基因在蘇太豬在脾中的表達量為最高，皮下脂肪中的表達水平僅次于脾，背最長肌與脾、肺和皮下脂肪的相對表達差異極顯著(p<0.01)，其余為差異不顯著(p>0.05)，表達量高低順序為脾>皮下脂肪>肺>心>胃>腎>肝>背最長肌；c/EBPα基因在蘇太豬的皮下脂肪的表達量最高，以背最長肌中c/EBPα基因的相對表達量比較，在肝、脾、皮下脂肪組織中表達差異極顯著(p<0.01)，肺的相對表達差異顯著(p<0.05)，其余組織中差異不顯著(p>0.05)，表達量的高低順序為皮下脂肪>肝>脾>肺>腎>心>胃>背最長肌。結果顯示PPARγ和c/EBPα基因在皮下脂肪組織中都有較高的表達水平，在背最長肌中的表達均為最低，PPARγ和c/EBPα基因在蘇太豬中各組織的相對表達量的趨勢趨于一致，推測PPARγ和c/EBPαx基因對蘇太豬的不同組織中脂肪沉積有協同作用。 圖4 PPARγ基因在組織的表達差異 Figure 4 PPARγgene expression differences in the organization 注:H:心;L:肝;Sp;脾;Lu:肺;K:腎;St:胃;LID:背最長肌;SF:皮下脂肪;圖中相同字母之間差異不顯著(p>0.05),不同字母之間差異極顯著(p<0.01) 圖5 c/EBPα基因在組織的表達差異 Figure 5 c/EBPαgene expression differences in the organization 注:H:心;L:肝;Sp:脾;Lu:肺;K:腎;St:胃;LID:背最長肌;SF:皮下脂肪;圖中相同字母之間差異不顯著(p>0.05),相同字母,大小寫不同的之間差異顯著(p>0.01);不同字母之間差異極顯著(p<0.01) 3 材料與方法 3.1 試驗動物 試驗動物選自貴州省白洗豬種質資源保護基地，選用10月齡健康無疾病的蘇太豬，按照國家《生豬屠宰操作規程》(GB/T17236-1998)標準進行屠宰，采集心、肝、脾、肺、腎、胃、背最長肌和皮下脂肪8個組織樣，錫箔紙包裝編號后放入液氮中保存，帶回實驗室轉入-80℃冰箱保存備用。 3.2 主要儀器 高壓滅菌鍋、紫外可見分光光度計、-80℃冰箱、PCR擴增儀(C1000 TouchTM)、凝膠成像系統(Universal HoodⅡ)、電泳儀、實時熒光定量PCR儀(型號為CFX96 Real-Time System)、高速冷凍離心機、電子恒溫水浴鍋、梯度PCR儀、制冰機、4℃冰箱、-20℃冰箱、振蕩器、小型離心機。 3.3 主要試劑 Trizol、氫氧化鈉、氯仿、液氮、異丙醇、75%乙醇瓊脂糖、0.5%TAE、槍頭、PCR管、1.5 m L離心管、5 m L與10 mL的塑膠試管、逆轉錄試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)等。 3.4 Trizol法提取組織總RNA 采用Trizol法提取8個組織樣的總RNA，吸取1μL的RNA于超微量紫外分光光度計測定其濃度和純度(OD260/OD280=1.8～2.0)，并用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA提取效果，將剩余的RNA放入-80℃冰箱保存。 3.5 cDNA第一鏈的合成 本研究預先將RNA模板、dNTP Mix、primer Mix、RT Buffer、HiFiscript和RNase-Free Water置于冰上溶解備用，其詳細反應體系如下：Control GAP-DH RNA(50 ng/μL)2μL、RiboLock RNase Inhibitor(20 U/μL)1μL、Primer Mix 1μL、5×Reaction Buffer 4μL、10 mmol/L dNTP Mix 2μL、Revert Aid RT(200 U/μL)1μL、Water(nuclease-free)9μL。將反應物于PCR儀上42℃孵育50 min,85℃孵育5 min，反應結束后，-20℃保存備用，取1μL反應產物于超微量紫外分光光度計進行濃度和純度檢測。 3.6 熒光定量PCR引物設計 從基因庫中查找PPARγ、c/EBPα目的基因，以GAPDH基因作為本次試驗的內參基因。用Primier5.0軟件設計引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。RT-PCR擴增引物的序列及其引物片段大小詳細信息如下(表1)。 表1 引物信息 3.7實時熒光定量PCR條件優化及熒光定量PCR反應 采用SYBR GreenⅠ熒光染料法在熒光定量PCR儀上進行表達水平檢測，運用RT-PCR摸索并優化反應條件，確定最佳反應體系。以GAPDH作為內參基因，用蘇太豬的心、肝、脾、肺等8個組織的c DNA為模板進行PPARγ與c/EBPα基因的熒光定量PCR擴增，反應條件為：95℃預變性10 min;95℃變性13 s;59℃退火30 s;72℃延伸32 s；進行循環40次后進行溶解曲線分析：95℃15 s,60℃15 s，然后以每10 s上升0.5℃的速率從60℃升到95℃。每個組織樣品的每個基因要求3個平行重復，熒光采集時間為5 s。 3.8實驗數據的處理分析及分析方法 本次試驗數據應用2-△△Ct法分析PPARγ與c/EBPα基因在蘇太豬心、肝、脾、肺、腎、胃、背最長肌和皮下脂肪8個不同組織中的差異表達量，測得的試驗數據用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析。 參考文獻 [1]Adams M.,Montague C.T.,Prins J.B.,Holder J.C.,Smith S.A.,Sanders L.,Digby J,E.,Sewter C.P.,Lazar M.A.,Chatterjee V.K.,and 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