14次 摘要：目的 原核表達三元融合蛋白MBP-SERPINA3-IFN-(簡稱MSIK),并在細胞和小鼠水平上對其抗人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)的功能進行研究。方法 構建三元融合蛋白MSIK的原核表達質粒pET30-MBP-SERPINA3-IFN-,將構建好的質粒轉入BL21(DE3)codon Plus --> 摘要：目的 原核表達三元融合蛋白MBP-SERPINA3-IFN-κ(簡稱MSIK),并在細胞和小鼠水平上對其抗人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)的功能進行研究。方法 構建三元融合蛋白MSIK的原核表達質粒pET30-MBP-SERPINA3-IFN-κ,將構建好的質粒轉入BL21(DE3)codon Plus大腸埃希菌并利用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactophyranoside,IPTG)誘導蛋白的表達,經親和層析純化得到蛋白,用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)驗證目的蛋白的純度,用1型單純皰疹病毒(herpes simplex virus type 1,HSV-1)分別在角質細胞中及BALB/c小鼠上驗證該蛋白的抗病毒活性,通過實時熒光定量PCR(Q-PCR)檢測樣本中病毒的含量。結果 該融合蛋白經IPTG誘導表達并由親和層析純化后,獲得相對分子質量約為100×103的純化蛋白,經SDS-PAGE法檢驗,并使用Image J進行灰度分析,該融合蛋白純度大于95%。在角質細胞中,該三元融合蛋白能夠有效抑制HSV-1病毒的復制,在小鼠皮膚創傷模型中,該三元融合蛋白同樣能夠有效抑制HSV-1病毒的復制并能夠促進創口的愈合。結論 成功表達了三元融合蛋白MSIK,并利用親和層析柱進行了有效的純化。獲得的融合蛋白具有良好的生物學活性,能夠有效抑制HSV-1病毒的復制并促進創口的愈合。該三元融合蛋白可用于研發有效的抗HPV護創敷料,用來治療一些由HPV引發的相關疾病。 關鍵詞：融合蛋白MBP-SERPINA3-IFN-κ; 原核表達; 親和層析; 人乳頭瘤病毒; 1型單純皰疹病毒; 促創口愈合; 人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)屬于乳頭多瘤空泡病毒科乳頭瘤病毒屬,為一組無包膜的小分子雙鏈環狀DNA病毒,人的皮膚和黏膜上皮細胞為其主要宿主細胞[1]。根據HPV的生物學特征和致癌潛能,可將其分為低危型和高危型[2-4]。其中低危型主要引起感染部位的低度病變、生殖器或皮膚疣和尖銳濕疣,而高危型HPV的持續感染與宮頸癌的發生密切相關[1,5]。 目前雖有較多的治療HPV感染的方法,但普遍使用傳統的治療手段[6]:如手術、激光、外涂藥物等,其目的都只是去掉臨床肉眼可見的疣體,卻難以解決亞臨床以及潛伏感染的問題,治標不治本,致使反復發作[7-8]。另外,雖然目前已經能夠通過接種HPV疫苗來預防HPV感染[9],但其成本很高,極大地限制了大范圍的推廣[5]。因此,目前由HPV感染引發的相關疾病的治療依然十分重要和嚴峻。 迄今為止,世界上治療HPV的抗病毒藥物極為匱乏。其中山西錦波生物醫藥股份有限公司開發的生物蛋白敷料(JB01-BD)被臨床試驗證明安全有效,也為宮頸癌的防治做出了一定的貢獻[10]。其活性蛋白質的作用機制,是針對HPV病毒的侵染和復制過程。但是,由于HPV在體內的復制效率很低,活體組織上很難檢測到活的HPV病毒。HPV感染所引起的宮頸癌和其他病癥往往并不是由HPV的直接感染造成,而是由于HPV致癌基因的整合,以及HPV慢性感染和長期低劑量復制對宿主的影響而引起,所以直接針對HPV活躍病毒的復制而進行抑制難于有好的效果[2]。 HPV感染后難以清除[11],一是由于子宮頸上皮細胞本身容易受到損傷,產生微創,給病毒傳播產生了通道;二是由于子宮頸上皮細胞的局部免疫系統不活躍,容易給病毒有可乘之機。 本研究針對這些問題,設計了一種三元融合蛋白MBP-SERPINA3-IFN-κ(簡稱MSIK)。其中,SERPINA3是一種近期發現的胰凝乳蛋白酶抑制劑,外敷時可以幫助上皮細胞的微小創口愈合,促進局部皮膚再生[12]。IFN-κ是新近發現的一種上皮細胞特異的Ⅰ型干擾素,激活上皮細胞的抗病毒免疫,抑制病毒復制[13]。MBP(麥芽糖結合蛋白)可以增加融合蛋白的可溶性及穩定性。經驗證,該融合蛋白同時具有SERPINA3 和IFN-κ的生物學活性及功能,這些特性為其成為一種抗HPV的生物蛋白敷料提供了潛在的可能。 1 材料與方法 1.1 菌株及載體 原核重組載體pET30(經本實驗室改造帶有MBP標簽),大腸埃希菌(Escherichia coli)株系DH5α和BL21(DE3) codon Plus均為本實驗室保存。 1.2 主要試劑及儀器 金牌MixDNA聚合酶購自擎科生物,限制性內切酶 Ssp Ⅰ、 Kpn Ⅰ、 Bamh Ⅰ 購自 Thermo Scientific公司(美國),重組酶購自南京Vazyme公司,蛋白Marker及DNA Marker購自Takara公司(日本),DNA凝膠回收試劑盒、質粒小量提取試劑盒購自Axygen公司(美國),PCR引物合成及重組質粒測序由金唯智公司完成,瓊脂糖、瓊脂粉購自生工生物,LB培養基購自BD公司(美國),水合氯醛購自生工生物,DMEM細胞培養基、FBS購自Hyclone公司(美國),移液管、培養皿、孔板等細胞實驗耗材購自耐思生物,TRIzol RNA 提取試劑購自Invitrogen公司(美國),RT Master Mix逆轉錄試劑盒購自Abm公司(加拿大),SYBR Premix Ex Taq Ⅱ購自Takara公司(日本),CO2恒溫培養箱購自上海Heal Force公司。mastercycler ep realplex2熒光定量PCR儀購自Eppendorf公司(德國)。Avanti JXN-26落地低溫超速離心機購自貝克曼庫爾特公司(美國)。 1.3 細胞及小鼠 BALB/c小鼠:南開大學實驗動物中心提供[許可證號:SYXK(津)2014-00003],角質細胞由暨南大學賓亮華實驗室惠贈。HSV-1病毒由南開大學曹又佳實驗室惠贈。 1.4 重組質粒的構建與鑒定 使用Overlap PCR方法以GGSGG為linker將SerpinA3基因和 IFN-κ 基因拼接到一起。PCR過程中使用到的4條引物分別為,引物1:SERPINA3-F:5′-TACTTCCAATCCAATGCCCACCCTAACAGCCCA-3′,引物2:SERPINA3-R:5′-CCCTCCACTGCCACCGGCTTGCTTGGGATT-3′,引物3:IFN-κ-F:5′-GGTGGCAGTGGAGGGCTGGACTGTAACTTA-3′,引物4:IFN-κ-R:5′-TTATCCACTTCCAA-TGCTATTATTTCCTCCTGAA-3′。使用SspⅠ 酶切處理pET30載體質粒,PCR產物和酶切載體經重組酶處理后轉化至DH5α。挑取單菌落并進行質粒提取,由金唯智公司進行測序鑒定。將測序正確的質粒命名為pET30-MBP-SERPINA3-IFN-κ。 1.5 重組質粒蛋白的誘導表達 將測序正確的質粒轉化到BL21(DE3)codon Plus大腸埃希菌感受態細胞中。挑取單菌落于100 ml LB(Kana抗性)液體培養基中,37 ℃,220 r/min恒溫振蕩培養 6～8 h至吸光度A600=0.6～0.8,以每份20～30 ml的量分裝到1 000 ml LB(Kana抗性)液體培養基中,37 ℃,220 r/min恒溫振蕩培養3～5 h至吸光度A600=0.6～0.8。每瓶加入100 μl濃度為1 mol/L 的IPTG誘導蛋白的表達,16 ℃,220 r/min恒溫振蕩培養12～16 h,4 000 r/min離心20 min收集菌體,以30 ml Binding Buffer(20 mmol/L Tris,0.5 mol/L NaCl)重懸菌體,置于-30 ℃保存備用。 1.6 融合蛋白的親和純化及鑒定 菌體解凍后進行超聲破碎,以4 ℃、18 000 r/min離心40 min。收取上清加至由Binding Buffer平衡的含有MBP親和beads的重力柱中,重復 3 次以增加結合效率。用10 ml的Binding Buffer洗滌柱子,重復 3 次從而去除雜蛋白,用MBP Elute Buffer(20 mmol/L Tris,0.5 mol/L NaCl,10 mmol/L麥芽糖)洗脫目的蛋白并收集洗脫組分,進行冷凍干燥處理后存于-80 ℃。最后,用質量分數為12%的SDS-PAGE膠結合考馬斯亮藍染色法分析目的蛋白的純度以及可能的降解情況。 1.7 RNA的提取、反轉錄及Q-PCR檢測 細胞樣品直接使用Trizol法提取總RNA,皮膚樣品經液氮冷凍研磨后使用Trizol法提取總RNA。提取的總RNA立刻進行反轉錄合成cDNA,反轉錄體系為:RNA 2 μg、RT Master Mix 4 μl、補RNase Free dH2O至20 μl。反應條件為:25 ℃ 10 min、42 ℃ 30 min、85 ℃ 5 min。反轉錄的cDNA進行Q-PCR檢測,反應體系為:SYBR green MIX 10 μl、 引物8 μl、cDNA 2 μl。 反應條件為:95 ℃ 2 min預變性、95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s,共40個循環,在每個循環結束時進行熒光信號檢測。 1.8 融合蛋白在角質細胞中對HSV-1的影響 接種適量角質細胞至六孔板,在37 ℃,5%CO2的恒溫培養箱中培養18～24 h,至細胞融合度到達70%左右。用不同濃度的MSIK蛋白處理2 h并以PBS處理作為對照,隨后使用HSV-1感染24 h,收取1×106個細胞用Trizol法提取總RNA。對總RNA進行反轉錄并使用實時熒光定量PCR檢測病毒拷貝。 1.9 小鼠皮膚創口愈合實驗及融合蛋白對皮膚創口中HSV-1的影響 1.9.1 小鼠皮膚創口的形成 取BALB/c雄性小鼠,使用剃須刀除凈背部毛發,用質量分數為4%的水合氯醛麻醉小鼠,體積分數為75%的乙醇棉球擦拭皮膚進行消毒,用直徑6 mm打孔器在小鼠背部制造皮膚創口。 1.9.2 融合蛋白對皮膚創口愈合的影響 每組 5 只 BALB/c雄性小鼠,在其背部制造創口,在創口處分別滴加10 μl濃度為50 μg/ml和100 μg/ml的融合蛋白溶液,以PBS溶液處理作為對照。每天重復進行上述處理,觀察創口愈合情況并進行創口大小的測量及統計,同時對創口進行拍照。 1.9.3 融合蛋白對皮膚創口中HSV-1的影響 每組3只BALB/c雄性小鼠,在其背部制造創口。在創口處滴加10 μl不同濃度的融合蛋白溶液并以PBS溶液處理作為對照,18 h后在創口處滴加滴度為1×109/ml的HSV-1病毒10 μl進行感染,隨后3 d重復進行上述處理。在第3 天,使用斷頸法處死小鼠,取小鼠創口以及周圍2 mm處的皮膚并在液氮中速凍。在研缽中快速將皮膚研磨成粉末(期間不斷使用液氮降溫防止RNA降解)。研磨后的皮膚使用Trizol法提取總RNA,將總RNA進行反轉錄并使用實時熒光定量PCR檢測病毒拷貝數。 2 結 果 2.1 三元融合蛋白MSIK的表達純化及鑒定 重組原核表達質粒pET30-MBP-SERPINA3-IFN-κ轉化到BL21(DE3)codon Plus大腸埃希菌,用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactophyranoside,IPTG)誘導后蛋白可以高效地進行表達。由MBP柱親和層析后可以獲得目的蛋白。經質量分數為12%的SDS-PAGE檢測,結果如圖1所示,破碎后的大腸埃希菌上清液中含有大量的目的蛋白,洗脫液樣品在相對分子質量約100×103 處可見清晰的目的蛋白的條帶,并且洗脫液樣品中無明顯可見的雜帶。經過濃度測定可知,1 L 大腸埃希菌可純化出5 mg左右的融合蛋白。 2.2 在角質細胞中融合蛋白MSIK有抑制HSV-1作用 由于HPV在體外很難培養,故本課題組使用跟HPV生活周期相近的HSV-1來進行代替。將角質細胞用不同濃度的MSIK蛋白處理2 h,隨后使用HSV-1感染24 h,由Q-PCR檢測各組細胞內病毒拷貝。結果如圖2所示,角質細胞經融合蛋白MSIK處理后,細胞內HSV-1的含量顯著降低,并且隨著蛋白濃度的提高,其對HSV-1的抑制作用愈強。說明該三元融合蛋白MSIK在角質細胞中對HSV-1具有顯著的抑制作用。 圖1 純化蛋白的SDS-PAGE分析結果 注:1為大腸埃希菌破碎離心后的上清液;2為流穿液;3為Binding Buffer洗脫液;M為蛋白分子量Marker;4為MBP Elute Buffer洗脫液。 圖2 MSIK蛋白對角質細胞內HSV-1增殖的影響 注:將角質細胞用不同濃度MSIK蛋白處理2 h后,HSV-1刺激24 h,使用Q-PCR檢測各組細胞內病毒拷貝。實驗結果來自3次獨立重復實驗,以平均值和標準差表示。數據統計采用雙尾t檢驗(aP<0.01,bP<0.001)。 2.3 融合蛋白MSIK能夠促進小鼠創口的愈合 分別以質量濃度為50 μg/ml和100 μg/ml的融合蛋白MSIK處理小鼠創口,以PBS溶液處理作為對照。每天重復進行上述處理,進行創口大小的測量及統計,并拍照。結果如圖3和圖4所示,融合蛋白MSIK能夠有效地加速小鼠創口的愈合,并且具有十分顯著的效果。對小鼠創口直徑進行統計和分析,結果顯示該融合蛋白的促創口愈合功能隨蛋白濃度的升高而加強,并且差異有統計學意義(P=0.03),穩定可信。 圖3 小鼠創口愈合圖 注:使用100 μg/ml MSIK蛋白處理創口,并以PBS處理為對照組。 圖4 小鼠創口直徑統計結果 注:每組5只小鼠,以不同濃度MSIK蛋白處理創口,實驗結果來自3次獨立重復實驗,以平均值和標準差表示。數據統計采用雙尾t檢驗(aP<0.05)。 2.4 融合蛋白MSIK對小鼠創口內的HSV-1具有抑制作用 使用不同濃度融合蛋白MSIK處理小鼠創口,18 h后用HSV-1病毒感染創口,連續處理3 d后,以Q-PCR檢測創口HSV-1的含量。結果如圖5所示,該融合蛋白能夠有效抑制皮膚創口內HSV-1的增殖,并且該融合蛋白對HSV-1病毒的抑制能力與其濃度呈正相關。實驗經3次重復,數據經分析差異有統計學意義(P=0.007)。 圖5 小鼠創口內HSV-1含量的檢測 注:使用不同濃度融合蛋白MSIK處理小鼠創口,隨后用HSV-1病毒感染創口,并以Q-PCR檢測創口HSV-1的含量。實驗結果來自3次獨立重復實驗,以平均值和標準差表示。數據統計采用雙尾t檢驗(aP<0.05, bP<0.01)。 3 討 論 HPV需要通過子宮頸鱗狀上皮細胞的微創口進入,才能在人體內完成感染。這些微創口很容易產生(如性交、上皮細胞死亡脫落、細菌感染等),一般不會流血和引起可見的炎癥而引人注意。自身的皮膚修復系統對這些微創口的修復非常緩慢。另外,子宮頸上皮細胞的局部免疫系統不活躍,很難對HPV的感染產生有效的免疫反應。所以,對于HPV感染的治療,在促進微創口愈合的同時,有效激活子宮頸上皮細胞的局部免疫系統,就顯得至關重要。 本研究設計的融合蛋白中,SERPINA3可以有效加快微創口的修復[12],使子宮頸鱗狀上皮細胞層形成完整的屏障,阻斷HPV的感染。IFN-κ可以有效激活局部的上皮細胞抗病毒免疫信號通路,抑制和殺滅HPV[13]。對比IFN-α或IFN-β,IFN-κ限定在上皮細胞表達,通過自分泌途徑激活,所以只在上皮細胞局部起作用,外敷時不進入血液循環,不會引起全身性反應,從而避免長期使用IFN-α和IFN-β時的不良反應。另外,近期的研究發現,IFN-κ與HPV感染緊密相關,HPV感染抑制IFN-κ的表達,而外源表達的IFN-κ可以抑制HPV的激活,IFN-α和IFN-β并不具備上述特征[14]。這2種活性蛋白的聯合使用,會有效解決HPV不易清除的難題。 由于IFN-κ具有很強的疏水性[15],因此,其單獨在原核表達系統中表達,基本以包涵體的形式存在。雖然包涵體經過變性復性也可以得到部分可溶的蛋白,但其操作復雜并且這些純化方式不利于后期的應用。本研究設計的三元融合蛋白MBP-SERPINA3-IFN-κ(MSIK)中,MBP(麥芽糖結合蛋白)可以極大地增加IFN-κ的可溶性與穩定性,還可以通過與細胞表面糖鏈的結合協助融合蛋白附著于細胞表面。SERPINA3本身的溶解性及穩定性均較好,也為整個融合蛋白的溶解及穩定提供了一定的幫助。本課題組獲得的融合蛋白具有良好的溶解性和穩定性,并且可以通過簡單的親和層析的方法得到大量的高純度蛋白,這些特性為其以后的應用提供了極大的幫助。 此外,本實驗結果顯示,三元融合蛋白MSIK具有良好的生物學活性,在細胞和小鼠個體水平均可有效抑制HSV-1的復制(由于HPV在體外很難培養,所以我們使用跟HPV生活周期相近的HSV-1來進行代替)。與此同時,在小鼠創口恢復過程中,該蛋白也能有效促進小鼠創口的愈合。 綜上所述,本研究設計的三元融合蛋白MSIK均一性好,易于純化,活性高,無不良反應,非常適合作為抗HPV的宮頸護創敷料,具有較為廣泛的應用前景。 參考文獻 [1] Ding YZ,Wen JY,Lai BL,et al.Caffeic acid has activity against the human papillomavirus[J].Bingdu Xuebao,2018,34(3):287-295.(in Chinese)丁永楨,溫嘉泳,賴寶龍,等.咖啡酸抗人乳頭瘤病毒感染的研究[J].病毒學報,2018,34(3):287-295. 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