【摘要】目的：探索人骨髓間充質干細胞（hBMSCs）提取的多系分化持續(xù)應激細胞（Muse細胞）對神經(jīng)炎癥微環(huán)境的抑制作用。方法：用脂多糖（LPS）誘導小膠質細胞炎癥反應后，收集hBMSCs細胞與Muse細胞上清液（CM）培養(yǎng)小膠質細胞，分為對照組、LPS組、BMSC-CM組、Muse-CM組。采用實時熒光定量PCR的方法檢測小膠質細胞炎癥反應水平。結果：Muse細胞上清液培養(yǎng)的炎癥預刺激小膠質細胞促炎因子腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）表達明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而抗炎標記物Arg-1的表達水平顯著增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論：Muse細胞可以在一定程度上抑制神經(jīng)炎癥微環(huán)境，促使小膠質細胞向抗炎表型轉變，對神經(jīng)炎癥性疾病有應用價值，值得進一步研究。
【關鍵詞】骨髓間充質干細胞 Muse細胞 神經(jīng)炎癥 抑制作用
在一些神經(jīng)退行性疾病中，小膠質細胞由于過度活化會釋放促炎因子，通過級聯(lián)反應使神經(jīng)炎癥反應增強，從而進一步損傷神經(jīng)系統(tǒng)。因此，目前許多研究致力于促使炎癥環(huán)境中的小膠質細胞向M2型轉變［1］，從而降低炎癥微環(huán)境中促炎因子的表達，增加抑炎因子含量，緩解炎癥損傷程度。
干細胞可以在神經(jīng)系統(tǒng)中起神經(jīng)保護作用，且在多系統(tǒng)中都具有一定的抗炎能力。多系分化持續(xù)應激細胞（multilineage differentiating stress enduring cell，Muse cell）可以從脂肪細胞、骨髓細胞等多種細胞中提取，是一種新型耐受性干細胞，目前多應用于細胞移植相關的疾病中，尤其是具有在組織修復過程中能大量分化為周圍組織細胞的特點［2］，為修復提供種子細胞。
目前，Muse細胞在神經(jīng)炎癥中的抗炎作用仍鮮有報道，故本研究通過Muse細胞上清液與炎癥性小膠質細胞的反應，探索其在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的抗炎效果，評估其在神經(jīng)炎癥治療中的可行性，為神經(jīng)炎癥相關疾病提供新的種子細胞。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
大鼠小膠質細胞系HAPI（ 深圳市豪地華拓生物科技有限公司）；脂多糖（LPS，美國Sigma公司）；澳洲胎牛血清（美國Gibco公司）；DMEM/F12培養(yǎng)基、α-MEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；RNA快速提取試劑盒（上海奕杉生物科技有限公司）；逆轉錄試劑盒、cDNA擴增試劑盒（日本Takara公司）；大鼠抗人SSEA-3抗體（美國Abcam公司）；羊抗大鼠Alexa Fluor® 647二抗（美國Abcam公司）。
1.2 Muse細胞的獲取與鑒定
從人骨髓血中分離獲得骨髓間充質干細胞（hBMSCs），當細胞擴增至第4代時，吸取上清液，加入胰酶進行細胞耐受8 h實驗以獲取Muse細胞。將Muse細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基中，置于polyHEMA包被處理的6孔細胞培養(yǎng)板進行懸浮培養(yǎng)。5～6 d后取出單個Muse細胞球，采用免疫熒光的方法檢測多能干細胞標志物SSEA-3表達，熒光顯微鏡下觀察蛋白表達情況并拍照。
1.3 獲取hBMSCs與Muse細胞培養(yǎng)上清液當hBMSCs與Muse細胞長至70%后，繼續(xù)貼壁培養(yǎng)48 h，用15 mL無菌離心管收集培養(yǎng)上清液并離心（10 min，400 g），棄去沉淀，保存于-20℃冰箱中待用。
1.4 實時熒光定量 PCR 檢測腫瘤壞死因子 α（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）和Arg-1 mRNA收集12孔板中的HAPI細胞，提取細胞總RNA，經(jīng)酶標儀檢測后，確保OD值為2.0左右，剔除不純的細胞RNA后進行RNA逆轉錄，并將cDNA置于-20℃保存。使用實時熒光定量PCR試劑盒，按預變性95℃ 30s，95℃ 5s，60℃ 30s循環(huán)40次，重復3次。
1.5 統(tǒng)計學方法
采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
2 結果
2.1 Muse細胞原代培養(yǎng)與鑒定
Muse細胞從hBMSCs中分離后，貼壁培養(yǎng)2 d，可見細胞胞體較hBMSCs細胞更小，但也呈現(xiàn)纖維細胞狀，胞體透亮（圖1 A）。Muse細胞在懸浮培養(yǎng)皿中經(jīng)過5 d培養(yǎng)可以成球，經(jīng)免疫熒光鑒定，其存在多能干細胞標志物SSEA-3（圖1 B）。
圖1 Muse細胞原代培養(yǎng)與鑒定
A：P1代Muse細胞形態(tài)（×20）；B：免疫熒光檢測Muse細胞表面標記物
2.2 Muse細胞上清液對炎癥性小膠質細胞TNF-α、IL-1β和Arg-1 mRNA水平的影響
實時熒光定量PCR法檢測HAPI小膠質細胞中TNF-α、IL-1β和Arg-1 mRNA的轉錄水平。100 ng/mL LPS刺激HAPI 6 h后洗去上清液，再將用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h的LPS組與對照組相比，TNF-α、IL-1β的mRNA水平顯著增加（P＜0.01），Arg-1的mRNA水平明顯降低（P＜0.01）；與LPS組相比，洗去LPS刺激液后選用干細胞上清液培養(yǎng)的HAPI細胞TNF-α、IL-1β的mRNA表達明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但BMSCCM組與Muse-CM組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與此同時，BMSC-CM組、Muse-CM組與LPS組比較，Arg-1的mRNA表達顯著升高，組間比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且Muse-CM組較BMSC-CM組的Arg-1表達水平也有顯著性增加，組間比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。
表1 Muse細胞上清液對炎癥性小膠質細胞TNF-α、IL-1β和Arg-1 mRNA水平的影響
組別 n TNF-α mRNA IL-1β mRNA Arg-1 mRNA
對照組 3 0.80±0.19 1.04±0.18 1.06±0.12
LPS組 3 10.94±1.04① 4.23±0.29① 0.16±0.15①
BMSC-CM組 3 7.25±0.54② 2.54±0.45② 0.34±0.07②
Muse-CM組 3 6.50±1.05② 2.39±0.40② 0.52±0.76②③
注：與對照組比較，①P＜0.05；與LPS組比較，②P＜0.05；與BMSC-CM組比較，③P＜0.05。
3 討論
中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)炎癥是神經(jīng)免疫學研究的重要課題。神經(jīng)免疫細胞中小膠質細胞和星形膠質細胞激活進入促炎狀態(tài)已被認為是幾種神經(jīng)退行性疾病中重要的病理特征。
小膠質細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最豐富的單核吞噬細胞。它們是急性和慢性疾病的中樞性炎癥反應的主要免疫細胞［3］。小膠質細胞被激活后會差異表達各種與促進或抑制炎癥過程有關的受體，本研究選用小膠質細胞常見的促炎因子TNF-α、IL-1β以及抗炎因子Arg-1作為研究對象，以探究Muse細胞對炎癥環(huán)境中的小膠質細胞炎癥因子mRNA表達水平的作用。本次實驗表明，hBMSCs細胞與Muse細胞對這兩種促炎因子的合成都具有良好的抑制效果。Arg-1作為抗炎小膠質細胞的重要表型，其合成水平在炎癥環(huán)境中被顯著抑制了。本次實驗發(fā)現(xiàn)，Muse細胞較hBMSCs細胞來說，其提升炎癥環(huán)境小膠質細胞的Arg-1合成能力更強。
綜上所述，Muse細胞與hBMSCs細胞類似，可以抑制炎癥環(huán)境中小膠質細胞促炎因子的表達，并且可以更大程度上誘導炎癥預刺激的小膠質細胞向抗炎表型轉變，但其內在的免疫作用機制仍需進一步探究。
【參考文獻】
［1］ KOBASHI S，TERASHIMA T，KATAGI M，et al．Transplantation of M2-Deviated Microglia Promotes Recovery of Motor Function after Spinal Cord Injury in Mice［J］．Molecular Therapy，2019，28（1）：254-265．
［2］ SHEN H，YONEDA S，YOUSEF ABU‐AMER，et al．Stem cell‐derived extracellular vesicles attenuate the early inflammatory response after tendon injury and repair［J］．Journal of Orthopaedic Research，2019，38（1）：117-127．
［3］ QIAO，YANG Q，JIA，et al．Neuroinflammation in the central nervous system：Symphony of glial cells［J］．Glia，2019，67（6）：1017-1035．
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文章名稱：學齡期兒童慢性腎臟病心理行為問題現(xiàn)狀調查分析及PFCC干預效果的研究
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